一、材料

無菌

實驗前 3 天制備飼養層（見方案 23.4)。照射 3T3 細胞（30 Gy) 和人成纖維細胞（70 Gy)，最好用含較多細胞的懸液
FAD:Wu 等 [1982] 研制的一種用于飼養層培養的高鈣培養液，含有 Ham's F12、DMEM 和添加物。Ham F12 和 DMEM 混合培養液（1:3) 添加 1.8Xl0-4mol/L 腺嘌呤、10-10mol/L 霍亂毒素、1～10ng/L EGF、0.4ug/ml 氫化可的（木公）、5%～10% FCS、100U/ml 青霉素和 50ug/ml 鏈霉素

角質形成細胞生長培養液（keratinocytegrowth medium，KGM ): 基于 Boyce 和 Ham [1983] 研制的 MCDB153 培養液的無血清培養液（見表 10.1 和附錄Ⅱ)，添加低鈣（0.03～0.5 mmol/L ) 牛垂體提取物。可加入 CaCl2，以升高鈣離子濃度
角 質形成細胞限定培養液（keratinocyte-definedmedium，KDM ) : 基于 Boyce 和 Ham 于 1983 年研制的 MCDB153 培養液的無血清培養液（見附錄 1)，是化學成分限定性培養液，Stark 等 [1999] 曾在器官型培養試用過

SKDM(supplemented KDM )：
(a) 不含垂體提取物的 KDM (Promocell、Clonetics)；
(b) 添加 5ug /ml 胰島素、0.5ug/ml 氫化可的（木公）、0.1ng /ml rhEGF 、20ug/ml
轉鐵蛋白、0.1% 髙純度血清白蛋白（無內毒素和脂肪酸，如 A-8806,Sigma) 和 50ug/ml 抗壞血酸；
(c) 調整鈣離子濃度至 1.3 mmol/L ;
(d ) 原代角質形成細胞可用未包被的塑料培養皿在 SKDM 中培養，然而細胞增殖活性較低。將角質形成細胞接種在涂有 I 型膠原蛋白的培養皿上時，生長情況可得到改善。

在含有成纖維細胞的膠原凝膠上作器官培養時，SKDM 對表皮生長和分化的作用與 FAD 的作用無區別

D-PBSA

0.5% EDTA(約 15 mmol/L )

分析級甘油
添加 20% FCS 和 10 % 甘油的 FAD 培養液

酶：
(a) 熱解素（T -7902,Sigma)；
(b)0.2% 和 0.6% 胰蛋白酶（1:250)；
(c)2.4U/mlⅡ型 dispase (Boehringer Mannheim)。

聚維酮碘溶液（10% 碘）

低溫保存管

50 ml 離心管

尼龍網

細胞濾器（BectonDickinson)

100 mm 細菌培養級 Petri 培養皿

手術刀和彎鑷



二、操作步驟

取材

1. 人皮膚常取自新生兒和幼兒的包皮，也可在手術時或尸檢后（死后 48 h 之內）取自軀干皮膚。在貼壁和增殖方面，自新生兒和幼兒的包皮分離的角質形成細胞優于自成人軀干皮膚分離的細胞。

2．將皮膚組織塊在聚維酮碘溶液（10% 碘）中孵育 30 min ，以預防感染。聚維酮碘溶液降低角質形成細胞的活力不明顯。

3．用 D-PBSA 浸洗 10 min,2 次。

分離表皮最好分離全厚皮膚

4．用 Castroviejo 取皮刀（Storz Instrument) 切取全厚皮膚，厚度為 0.1～0.2 mm 。可用彎剪除去皮下組織和部分真皮。

5. 用手術刀將皮膚切成 1 cmX2 cm 小塊。

6. 用 D-PBSA 浸洗組織塊 2～5 次。

7. 通過下列其中之一步驟用蛋白酶孵育組織塊。
(a) 胰蛋白酶：在 37℃ 條件下，將皮膚組織塊放入含有 0.6% 胰蛋白酶的 D-PBSA (pH 7.4) 中，漂浮 20～30 min。此步驟也對全厚皮膚消化很有效。
(b) 冷胰蛋白酶在 4℃ 條件下，將組織塊放人預冷的 0.2 % 胰蛋白酶中，漂浮 15～24 h 。需用酚紅顯示胰蛋白酶液的 pH, 以免 pH 變化引起酶活性和細胞活力的改變。
(c) II 型 dispase: 在 37℃ 條件下，用 2.4U/ml dispase 畔育 30 min 。
(d ) 熱解素：在 4℃ 條件下，用 0.5 mg/ml 熱解素孵育 12～16 h 。

8. 仔細觀察表皮的分離情況。當在皮膚組織塊邊緣見到表皮開始分離時，將組 織塊放人 100 mm 塑料 Petri 培養皿內，真皮側朝下。然后，加入 5 ml 含有血清的*培養液。

9. 用兩把細彎鑷剝下表皮，然后將表皮收集入含有 20 ml *培養液的 50 ml 離心管。
(a) 用胰蛋白酶分離時，通過用吸管輕輕吹打和用孔徑為 100um 的尼龍網 (細胞濾器，B-DBiosciences) 過濾即可從表皮分離出有活力的角質形成細胞。 .
(b) 從經 dispase 或熱解素消化分離的表皮獲取細胞時，需在 37℃ 條件下將表皮用胰蛋白酶和 1.3 mmol/L EDTA 液（濃度分別為 0.2% 和 0.05%) 孵育消化 10 min。

10. 用胰蛋白酶分離皮膚后，從真皮輕輕刮取附著不牢固的表皮細胞，然后將刮取的細胞加入表皮細胞懸液。如果角質形成細胞的純度不太重要，這一方法能夠獲得較多的表皮細胞。但是，角質形成細胞培養中有很多間質細胞污染。

11．通過離心（100 g，10 min) 將分離的表皮細胞用培養液洗 2 次。計數細胞總數和不吸收臺盼藍的活細胞數（見方案 21.1)。

原代培養

12. 調整細胞密度。在 37℃ 條件下，用 FAD 或 KGM 接種細胞。
(a) 3 天前將有絲分裂后的 3T3 細胞 [Rheinwald and Green，1975](見方案 14.3) 或皮膚成纖維細胞 [Limat et al，1989] 接種于培養皿。以 2X104～5X104 個/cm2 密度將角質形成細胞接種在飼養細胞上，用 FAD 培養。
(b) 如不用成纖維細胞培養，在 FAD 以高密度（1X105 ～5X105 個/cm2) 接種原代角質形成細胞，并在傳代培養時保持高細胞密度。
(c) 在含有低濃度鈣離子（0.03～0.1 mmol/L 的 KGM 中，以低密度 (1X103 個/cm2) 或高密度（5X104 個/cm2) 接種細胞。用同樣的培養液作傳代培養。
(d) 在 SKDM 中，細胞貼壁和生長較慢，故最好將 SKDM 用于需要增殖活性低的實驗。

13. 1～3d 后，細胞貼壁。細胞貼壁后，用培養液充分浸洗細胞，除去未貼壁的死細胞和已分化的細胞。然后/加人 FAD 或 KGM ，繼續培養：可通過調整 KGM 的鈣離子濃度促進角化和減慢生長。

傳代培養

14. 傳代培養方法如下。
(a) 用 FAD 培養
    (i) 用 1.3～2.7 mmol/L (0.05% 0.1%) EDTA 液孵育細胞 5～15 min ，使細胞去附著。此時，可見細胞間隙變大。
   (ii) 在 37℃ 條件下用 0.1% 胰蛋白酶和 1.3 mmol/L(0.05%) EDTA 液孵育細胞 5～10 min，然后用吸管輕輕吹打，使細胞充分去附著。
(b) 用 KGM 培養
   (i) 由于 KGM 的鈣離子濃度較低，不需要用 EDTA 預處理。
  (ii) 如用 FAD 培養方法，用 0.1% 胰蛋白酶和 1.3 mmol/L EDTA 液孵育細胞。

低溫保存

15. 為了保存大量自同種組織分離得到的細胞，常需進行低溫保存。取匯合前的原代培養細胞時，低溫保存效果好。
(a) 按前述的方法用胰蛋白酶消化細胞，離心（100 g，10 min)。
(b) 用含有血清的*培養液混懸細胞，計數。
(c) 用含有 20% FCS 和 10 % 甘油的 FAD 將細胞密度調整至 2X106 個/ml，
然后將細胞分裝人凍存管。
(d) 在 4℃ 條件下將凍存管放置 1～2 h。
(e) 用程控冷凍儀（Planer) 按 1℃/ min 的冷卻速度冷凍細胞。也可將凍存
管插人充滿異丙醇的細胞冷凍盒（如 1℃ 冷凍容器，商品號 5100-0001，NalgeNunc) 中。這樣，將細胞冷凍盒放入-80℃ 冷凍箱時，使冷卻速度適當。
(d) 細胞復蘇：
   (i) 將凍存管在 37℃ 水浴中快速融化。
   (ii) 用培養液將細胞稀釋 10 倍。
   (iii) 將細胞離心后，用所需培養液將細胞混懸至合適密度。然后，將細胞接種于培養皿。