步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙酸銨（10 mol/L）

DTT (1 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

NaCl ( 5 mol/L)

酚：氯仿（1:1, V/V)

5X TBE 電泳緩沖液

Tris-Cl (1 mol/L，pH 7.6)

2. 酶和緩沖液

10X Klenow 基礎緩沖液（500 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5)，100 mmoI/L MgSO4，過濾除菌后，分裝成小份貯存于 -20℃。）

大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

適于制備所需探針的限制性內(nèi)切核酸酶

3. 凝膠

變性聚丙烯酰胺凝膠或堿性瓊脂糖凝膠

4. 核酸與寡核苷酸

含有濃度各 20 mmol/L 未標記的 dCTP、dGTP 和 dTTP 的 dNTP 溶液

dATP ( 40 μmol/L 和 20 mmol/L)

寡核苷酸引物（M13 噬菌體通用引物或定制的寡核苷酸）

模板 DNA

5. 放射性復合物

[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 800~3000 Ci/mmol）

6. 專用設備

放射性墨水標記的黏性貼片或磷光黏性貼片（如 Glogos, Stratagene 公司）

盛有 85℃ 水的燒杯（250 ml）和微量離心管的支架

Sephadex G-50 離心柱，用 TE ( pH 7.6)平衡

預熱至 68℃ 和 85℃ 的水浴或加熱塊

預熱至限制性內(nèi)切核酸酶消化的適當溫度的水浴

二、方法

1. 在一個 0.5 ml 的微量離心管中混合：

單鏈模板（M13 噬菌體或噬粒 DNA ) ( 約 0.5 pmol)  1 μg

寡核苷酸引物                                                         5 pmol

10X Klenow 基礎緩沖液                                          3 μl

水                                                                         加至 20 μl

2. 85℃ 加熱反應混合物 5 min，然后緩慢冷卻至 37℃。

3. 在含有復性的引物和模板的試管中加入：

0.1 mol/L DTT                                    2 μl

10 mCi/ml [α-32P] dATP

( 比活性 3000 Ci/mmol)                       5 μl

40 μmol/L dATP                                 1 μl

20 mmol/L dTTP、dcTP 和 dGTP 溶液 1 μl

輕敲管外壁以混合各成分。以最大速度在微量離心機中離心 1~2s 使所有液體沉降至管底。

4. 將 0.5 μl 的混合物轉(zhuǎn)移到含 15 μl 20 mmol/L EDTA（pH 8.0）的微量離心管中，將管置于冰上。

5. 在剩余的反應混合物中加入 1 μl ( 5 單位）的 Klenow 片段。輕敲管壁使反應各組分混勻。室溫溫育反應 30 min。

6. 取 0.5 μl 的反應物轉(zhuǎn)移至含有 20 μl 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0 ) 的新的微量離心管中。將管置于冰上。

7. 在剩余的反應液中加入 1 μl 20 mmol/L 未標記的 dATP，輕彈管外壁以混合反應物。以最大速度離心 1~2s 使所有液體沉降到管底。室溫下繼續(xù)溫育 20 min。

8. 在 20 min 溫育過程中（步驟 7)，用步驟 4 和步驟 6 中保存的樣品來確定轉(zhuǎn)移至 10% 三/氯/乙/酸（TCA）可沉淀物或附著于 DE-81 濾膜的分子的放射性活度的比率。

9. 于 68℃ 加熱反應物 10 min 以滅活 Klenow 片段。

10. 調(diào)整反應中 NaCl 的濃度使之符合所選用的限制性內(nèi)切核酸酶最適酶切條件。切記引物延伸反應中 NaCl 濃度為 50 mmol/L。

11. 加 20 單位所需的限制性內(nèi)切核酸酶，在適當溫度下溫育 1 h。

12. 用標準的酚: 氯仿抽提法純化 DNA，通過離心柱層析或用 2.5 mol/L 乙酸銨和乙醇分級沉淀法除去未摻入的 dNTP。加 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 至終濃度為 10 mmol/L。

13. 根據(jù)片段大小選用變性聚丙烯酰胺凝膠或堿性瓊脂糖凝膠電泳分離放射性標記的 DNA。

14. 電泳后，準備進行凝膠的放射性自顯影。將凝膠在 X 線膠片上曝光 5~10 min。

15. 底片沖好后，利用磷光點（Glogos) 或放射性墨水斑點將顯影膠片與凝膠對齊。將膠片貼于凝膠上，在凝膠板的背面標出引物延伸的放射性 DNA 片段的位置。撤去膠片，切下含有所需 DNA 片段的凝膠塊。

16. 如用聚丙烯酰胺凝膠分離 DNA 片段與模板，則進行步驟17。如用堿性瓊脂糖凝膠，在洗脫放射性標記的 DNA 之前，應先在 0.5 mol/L Tris-Cl( pH 7.6 ) 中輕輕振蕩 45 min、然后在 0.5X TBE 中振蕩 45 min 以中和凝膠。

17. 采用電洗脫法抽提凝膠中的 DNA 或擠碎聚丙烯酰胺凝膠塊，再將其浸泡于適當緩沖液以便抽提 DNA。

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