原理

傳統上的細胞凍存（甘油/二甲基亞砜做保護劑）講求的是：慢凍速溶。細胞凍存時向培養基中加入的甘油或二甲基亞砜（DMSO），這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。

用途

細胞保種

材料與儀器

【實驗材料】細胞、DMSO、0.25% Trypsin-EDTA（或細胞刮刀）、100 X雙抗、PBS、胎牛血清、DMEM *培養基、75% 乙醇、胰酶、異丙醇；

【儀器與用品】凍存管、37度恒溫水浴鍋、培養皿（6 cm）、細胞凍存盒（已添加異丙醇）或凍存泡沫盒、記號筆、-80度冰箱、倒置相差顯微鏡、凍存管、37度恒溫水浴鍋、培養皿（6cm）、液氮罐、離心機、細胞房專用超凈臺、移液槍及移液槍頭（無菌或滅菌后烘干）、一次性細胞計數板、細胞自動計數儀、培養箱、移液管。

步驟

 1.  預先配制凍存液：按正常培養基：DMSO =9:1比列配制凍存液;

2.  取對數生長期細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，離心1000 rpm，5 min;

3.  去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/mL～1×107/mL;

4.  將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml;

5.  在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間、細胞代數及操作者;

6.     往凍存盒中加入異丙醇（在負八十冰箱中能以1℃/min的速度下降）放入負八十冰箱即可，建議12小時以上，一般可在負八十中保存半年至一年，長期保存要轉移至液氮中；商用凍存液可以直接凍存管放負八十冰箱。

注意事項

1、液氮凍存不建議用國產凍存管，復蘇時容易爆管；

2、消化細胞時，不能過度消化；

3、DMSO溶于DMEM培養基會放熱，應提前5-10分鐘配置凍存液。用凍存盒時避免異丙醇將標記擦掉；

4、二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜，包括皮膚和橡膠手套。因此，應謹慎處理。將凍存管放入液氮時，必須使用保護性手套和面罩。

常見問題

1、細胞消化過度，導致復蘇時細胞狀態不好；

2、負八十冰箱中長期保存細胞效果不好，應及時將細胞轉移至液氮中；

3、國產凍存管在液氮中容易漏液氮，導致復蘇時曝管，所以放液氮中盡量使用質量較好的凍存管。