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    一氧化氮合酶組化顯示法

    發(fā)布時間： 2023-01-13　　點擊次數(shù)： 829次

    簡介

    細胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍（NBT），使后者還原成藍黑色沉淀。

    原理

    一氧化氮合酶組化顯示實驗的基本原理是細胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍（NBT），使后者還原成藍黑色沉淀，此即 NADPH 所在部位，也可代表 NOS 的所在部位。

    材料與儀器

    器材：

    染色缸、載玻片、蓋片、24孔板、毛筆、解剖器材、灌注器材、冰凍切片機、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學顯微鏡、大鼠。

    試劑：


    ①孵育液（NADPH、NBT）
    （還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），3 mg ；硝基四氮唑藍(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L  PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL ）;
    ②0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（PB）


    （磷酸二氫鈉（NaH2PO4•2H2O），3 g ；磷酸氫二鈉（Na2HPO4•12H2O），29 g ；加少量蒸餾水，調(diào) pH 7.2～7.4，最后定容至1000 mL ）;

    ③1％Triton X-100。
    ④3％Triton X-100
    ⑤1％中性紅
    ⑥梯度乙醇
    ⑦0.01 mol ／ L PBS
    ⑧4％多聚甲醛
    ⑨中性樹膠

    步驟

    一氧化氮合酶組化顯示實驗的基本過程可分為如下幾步：


    （一）腦組織冰凍切片


    A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊，浸30％蔗糖后行冰凍切片（片厚40 μm ）。

    B．將切片浸入0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（0.1 mol ／ L PB，pH 7.2～7.4）中漂洗10 min ，重復3 次 。

    C．1％Triton X-100（用0.1 mol ／ L PB配制，pH7.4）中，室溫，預浸60 min 。

    D．浸入孵育液中孵育，37 ℃ ，3 h 。

    E．3％Triton X-100,4 ℃ ，過夜。

    F．0.1 mol ／ L PB中漂洗5 min ，重復3 次 。

    G．裱片，風干。中性紅復染。

    H．常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

    （二）細胞爬片或甩片


    A．細胞爬片或甩片，0.01 mol ／L PBS漂洗5 min ，重復3 次 。

    B．4％多聚甲醛固定，室溫，30 min 。

    C．0.01 mol ／ L PBS漂洗10 min ，重復3 次 。

    D．按上述腦組織冰凍切片步驟（3）～（6）操作。

    E．中性紅復染，常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

    注意事項

    1．冰凍切片采用的是漂浮法，有利于孵育液充分進入組織。

    2．本方法屬于酶組化，要選擇適當?shù)墓潭ㄒ汉颓‘數(shù)墓潭〞r間和方法，否則會影響酶的活性。

    3．此方法加 Triton X-100 可以改善著色效果，降低非特異性背景染色。但 Triton X-100 預浸時間不能超過2 h ，孵育液中 Triton X-100 濃度不能高于2％，否則影響著色效果。孵育液中后加 Triton X-100 ，防止 NBT 難溶。


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